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核酸浓度检测(二)——读数解读及注意事项

更新日期:2017年3月24日 大字 小字
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我们获得了Micro Drop超微量分光光度计检测结果后,对光谱的正确分析至关重要。


出结果的含义

1. A260nm——核酸最高吸收峰的吸收波长。

2. A280nm——蛋白最高吸收峰的吸收波长。

3. A230nm——是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长。

4. A340nm——是基线校准波长,为检测溶液样品的浊度和其他干扰因子。该值应该接近0.0。如果不是,表明溶液中有悬浮物,需要纯化样品。纯样品的A340一般是0。

   A230产生负值主要是由于在很低 DNA 浓度的溶液中的一些其他成分的干扰所导致的。在下一个测定中,需要降低样品的稀释度,A230的负值会被校正。

   A260/A280比值可进行核酸样品纯度评估:纯DNA的A260/A280比值为1.8,纯 RNA的A260/A280比值为2.0。如果比值低,表示受到蛋白(芳香族)或酚类物质的污染,需要纯化样品。

●   A260/A230比值可进行核酸样品纯度评估:纯 DNA和RNA的A260/A230比值为 1.8 – 2.2。若比值小于1.8表明样品被碳水化合物(糖类)、盐类或有机溶剂污染,需要纯化样品。当 260/230<1 时,通常只有两种情况。一是胍盐污染,二是蛋白污染。


本的不同提取方法对检测的影响: 

●   苯酚/ Trizol萃取——残留试剂污染可以通过220至240nm之间的异常光谱以及260至280nm区域的偏移来表示。加氯仿离心后取上清的时候千万不要贪多,那样就很容易被蛋白污染。

●   纯化柱提取——残留胍可能有助于230nm附近的峰值和从230nm到240nm的波谷偏移。

●   磁珠法提取——残余珠可能会导致光散射,并导致异常光谱。

操作注意事项: 

1. A260/A280、A260/A230比值受溶液酸碱度及离子强度的影响,如酸溶液会使A260/A280比值降低,低离子强度和低 pH 溶液会增加 280 nm 处的光吸收值。因此必须确保空白检测和溶解样品所用Buffer的离子浓度和pH值一致。

2. 浓度接近2 ng/μl浓度的样品可能会导致不可靠的260/280和/或260/230的比值。

3. 样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素,由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒,尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在会干扰测试效果。样品的浓度不能过低,或者过高(超过光度计的测试范围)。

4. 样品混合要充分,否则吸光值太低,甚至出现负值;混合液不能存在气泡,空白液无悬浮物,否则读数漂移剧烈。样品混合不均匀会直接导致检测不确定,重复性低。

5. 样品检测上样量不能太少,必须能够保证能后连接上下两根光纤形成光柱,从而使得检测正常进行。

6. 样品台清洁,在检测前,检测后以及连续使用仪器30分钟后均需要对上下接触样品的部位用双蒸水或纯水擦拭。

7. 切忌不可用喷壶在样品台上喷射,以防液体液体进入仪器内部造成损坏。

8. 切忌不可用洗涤剂或异丙醇清洁基座。

9. 仪器放置位置应当远离通风口,以免液滴蒸发太快导致浓度读数偏大。

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