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进阶的PCR,了解一下

更新日期:2019年7月1日 大字 小字
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导读
盘点PCR技术

PCR技术是模拟体内DNA的天然复制过程,在体外扩增DNA分子的一种分子生物学技术,主要用于扩增位于两段已知序列之间的DNA区段。

PCR分类

PCR技术自1983年Kary Mullis发明以来,在经典的梯度PCR基础上,又拓展了新的PCR技术。不同PCR技术的涌入,急速壮大了PCR家族。



PCR分类

篇幅有限,先从入门级PCR涉及到的Hot start PCR(热启动PCR)、Long PCR(长片段PCR)、Touchdown PCR(降落PCR)开始讲起。



热启动PCR

在模块温度到达设定的变性温度之前,模块内的样品往往要一起经历加热的过程,此时Taq酶仍具有一定活性,部分的引物和模板会在酶的作用下进行非特异性的结合、延伸,消耗反应物, 导致特异性扩增减少。目前一般采用温控系统或使用特殊Taq酶避免此现象的发生,称之为热启动PCR。


Long PCR(长片段PCR)


 Long PCR(长片段PCR)则可以满足较长片段的DNA片段的扩增需求,常用Taq酶和Pfu酶混合使用并配以特殊的缓冲液,避免错误的dNTP加入到片段中。在正常10-15个循环之后,每一个循环的延伸时间都要上一次循环的延伸时间多出10秒左右,以此配合完成正确的延伸。





Touchdown PCR(降落PCR)

由于影响PCR效率的因素有很多,比如引物、退火温度,循环次数等,逐一验证选择最适条件会花费大量的时间及成本,因此,降落PCR是针对一系列不太的退火时间来考量的:退火温度的起始值高于T值15℃,每一个(或n个)循环后比之前的循环的退火温度都要低,直到温度等于或低于T值,此后,在低温环境下再进行几个循环,以此达到特异性扩增的目的。高温环境能使部分特异性结合发生,再降温,某些非特异性扩增已不具备优势,因此能够高效扩增。



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